動物性產品中獸藥殘留的快速檢測方法
2012/4/20
[6336]
動物性(xing)產品中獸藥(yao)殘留的(de)快速檢測方法(fa)
—— ELISA & CharmⅡ
一、前言(yan)：
1、 ; 現狀
目(mu)前獸醫用(yong)藥(yao)幾乎(hu)占(zhan)據(ju)了所有(you)(you)抗微生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)藥(yao)物(wu)的(de)(de)50%，因此食品病(bing)原菌、條件(jian)致病(bing)菌和(he)共生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)菌不(bu)可(ke)避免的(de)(de)成了耐(nai)藥(yao)菌。在過去(qu)的(de)(de)50年中大(da)約(yue)有(you)(you)100萬噸(dun)的(de)(de)抗生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素被釋(shi)放到生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)圈(quan)中。歐洲(zhou)動(dong)物(wu)衛生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)聯盟（European Federation of Animal Health ，FEDESA）對歐盟和(he)瑞士抗生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素使用(yong)統計數據(ju)表明，僅(jin)1997年用(yong)于(yu)人類健(jian)康的(de)(de)抗生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素達5460噸(dun)，用(yong)于(yu)動(dong)物(wu)健(jian)康的(de)(de)抗生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素達3465噸(dun)，用(yong)于(yu)動(dong)物(wu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長促進(jin)劑的(de)(de)抗生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素達1575噸(dun)，并有(you)(you)逐年增加的(de)(de)趨勢(shi)。
在(zai)我國(guo)，由于獸醫(yi)用(yong)藥(yao)制度的(de)不完善及一(yi)些養(yang)殖廠(chang)受經濟利益的(de)驅使及相應的(de)檢(jian)測監督體系不健全，藥(yao)物(wu)的(de)濫用(yong)現象更為嚴(yan)重，動物(wu)產品中(zhong)獸藥(yao)的(de)污(wu)染時有(you)發生(sheng)。其(qi)潛(qian)在(zai)的(de)致癌、致畸作用(yong)引起了社會的(de)普遍(bian)關注，由于(yu)水(shui)產(chan)品(pin)中氯霉素含量(liang)(liang)過(guo)高，歐盟委(wei)員會(hui)于(yu)今年1月作出禁止中國動(dong)物(wu)源食品(pin)進(jin)口的(de)(de)協議，使得我國水(shui)產(chan)品(pin)對歐盟出口嚴重受挫，雖然現在部(bu)分產(chan)品(pin)開始解(jie)禁，但形式(shi)依然不容樂觀(guan)；美國、日本等國也開始高度關注(zhu)我國水(shui)產(chan)品(pin)的(de)(de)質量(liang)(liang)，并出臺一(yi)系列(lie)相關政策，對我國出口動(dong)物(wu)性產(chan)品(pin)進(jin)行限制。在現(xian)代文明的(de)世(shi)界，健康*的(de)貿易法則將是關稅、價格(ge)、質量所不可(ke)比擬的(de)，政治(zhi)上的(de)友(you)好往來無法替代經濟貿易中(zhong)的(de)游戲規則。
2、食品中(zhong)獸藥殘留對(dui)人類的危害(hai)
2.1耐藥菌(jun)株的(de)產生
抗生(sheng)素使用和細菌(jun)耐藥(yao)性永(yong)遠是互(hu)相(xiang)依存、互(hu)相(xiang)制約的(de)矛盾(dun)的(de)兩(liang)個方(fang)面，細菌(jun)耐藥(yao)非(fei)正常(chang)增加，往往是抗生(sheng)素的(de)非(fei)正常(chang)使用的(de)結(jie)果。早在1920-30年青霉(mei)素問世(shi)時(shi)，Dr Fleming就提(ti)出了(le)青霉素(su)的(de)(de)耐藥(yao)性(xing)問題(ti)。隨(sui)著時代的(de)(de)發展和各(ge)種新藥(yao)的(de)(de)出現，耐藥(yao)性(xing)菌株也接踵(zhong)而至（即包(bao)括(kuo)(kuo)藥(yao)物選擇壓力的(de)(de)結果(guo)也包(bao)括(kuo)(kuo)細菌自身的(de)(de)進化(hua)）。抗生(sheng)素的(de)副(fu)作(zuo)用以及耐藥菌株的(de)存(cun)在將嚴重威脅著人類的(de)健康(kang)，而且臨床亞治療水平(ping)的(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素更容易促使抗(kang)性基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)轉(zhuan)移(yi)，比如對動(dong)物進行低水平(ping)四環素治療，其糞腸(chang)菌(jun)(jun)群由(you)對四環素敏感逐漸變成抗(kang)四環素zui后(hou)發展成對其它藥物也產生(sheng)(sheng)抗(kang)性。在(zai)長期的(de)(de)生(sheng)(sheng)活(huo)中(zhong)，恰恰是(shi)人類(lei)和動(dong)物腸(chang)道的(de)(de)正常(chang)菌(jun)(jun)群成了耐藥基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)儲存庫，并不斷(duan)的(de)(de)將耐藥基(ji)(ji)因(yin)轉(zhuan)移(yi)給致(zhi)病(bing)菌(jun)(jun)，并在(zai)人和動(dong)物中(zhong)交叉傳(chuan)播(bo)，尤其是(shi)釋放到環境(jing)中(zhong)耐藥菌(jun)(jun)的(de)(de)危害更為嚴重，可(ke)造成耐藥基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)迅速轉(zhuan)移(yi)。
2.2抗生(sheng)素(su)的毒(du)副(fu)作用
殘留在(zai)動(dong)物性食品(pin)中的抗生素被(bei)人(ren)(ren)們食用(yong)后，除了(le)加速人(ren)(ren)體內耐(nai)藥菌株的進(jin)化之外，抗生素本(ben)身的毒副(fu)作用(yong)往(wang)往(wang)威脅(xie)人(ren)(ren)類(lei)尤其是孕婦和嬰兒(er)的健康，這一點在(zai)過去往(wang)往(wang)很容易被(bei)忽(hu)視。
2.2.1氯霉(mei)素
主要由Streptomyces venezuelae產生，目前已能人工合(he)成。它能抑制細菌(jun)蛋白質生物(wu)合(he)成，其效應部位位于(yu)核(he)糖體上，因而(er)對大多(duo)數G+菌和G－菌都有殺傷力。氯(lv)霉(mei)素的毒副(fu)作用(yong)較多，其(qi)常(chang)見的是再生(sheng)障(zhang)礙(ai)(ai)貧(pin)血、造血功(gong)能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺和運動(dong)障(zhang)礙(ai)(ai)及休(xiu)克。雖然氯(lv)霉(mei)素在動(dong)物(wu)疾病防治上曾發(fa)揮過一(yi)定的作用(yong)，但由于氯(lv)霉(mei)素可(ke)以(yi)產(chan)生(sheng)致(zhi)命性的副(fu)作用(yong)，因此歐盟已(yi)經(jing)在畜牧、水產(chan)業生(sheng)產(chan)中禁止使用(yong)。
2.2.2b－內酰胺
b－內酰胺類抗生素通過抑制(zhi)細菌轉肽(tai)酶的活性而干擾(rao)細胞壁(bi)肽(tai)聚糖的合(he)成，安芐青霉素和(he)青霉素G是該(gai)類(lei)zui常見的(de)兩種化合(he)物，由Penicillium chrysogenum產生。它可以(yi)通過(guo)胎盤傳給胎兒，也(ye)能通過(guo)乳腺進入乳中。zui常見(jian)的(de)(de)副作(zuo)用(yong)是以(yi)皮膚出現(xian)紅斑(ban)為主要(yao)癥狀(zhuang)的(de)(de)過敏(min)反應(ying)以(yi)及胃(wei)腸道(dao)紊亂引起的(de)(de)腹瀉、惡(e)心和嘔吐(tu)。
2.2.3四環(huan)素
包(bao)括Oxytetracycline （土霉(mei)素，OTC）、tetracycline （四(si)環素，TC）、 chlortetracycline （金霉素，CTC） 和(he)doxycycline （強力霉(mei)素，DC）等(deng)。
2.2.4 b－興奮(fen)劑
為擬交感神經(jing)類(lei)藥物，該類(lei)興奮劑的(de)受體為b2受體(ti)故得名。該類興奮劑(ji)可以(yi)促使肌肉骨骼肌血管壁擴張、支氣(qi)管和(he)子宮平滑肌松弛。因(yin)而在獸醫(yi)臨床上b2興奮(fen)劑被廣泛用作支氣管(guan)擴張(zhang)藥(yao)和(he)(he)子宮松弛藥(yao)，同時也被非法(fa)用作動物(wu)營養(yang)再(zai)分配(pei)的促生長劑。副作用，如：焦躁、震顫、過(guo)敏(min)、神(shen)智不清、食欲不振、惡心(xin)(xin)和(he)(he)嘔(ou)吐等以及心(xin)(xin)悸(ji)、高血壓、心(xin)(xin)律失常(chang)、心(xin)(xin)動過(guo)速等心(xin)(xin)血管(guan)癥狀，其中(zhong)擬交(jiao)感神(shen)經類(lei)物(wu)質在組織(zhi)中(zhong)的溢出均(jun)可導致(zhi)組織(zhi)壞(huai)死。
2.2.5雌激素
是一種人工合成的非固醇類雌激素，主要用于治療婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質；在肝臟中代謝緩慢，zui終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動、改變月經周期、乳房異常發育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、頭痛、皮膚紅斑、風疹。對于雄性動物來說，大劑量的雌激素可以增加血管栓塞的危險。此外，雌激素還能引起子宮內膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌激素還可以導致骨骼發育閉合，停止生長。也能促使生殖道變形，對于雄性動物能使精子變形以及嘔吐等。
2.2.6氨基甙類(lei)抗生素(su)
主(zhu)要(yao)包括(kuo)慶大霉(mei)(mei)素(su)(su)、鏈(lian)(lian)霉(mei)(mei)素(su)(su)、新霉(mei)(mei)素(su)(su)、卡那霉(mei)(mei)素(su)(su)等(deng)(deng)，為以氨基環醇和氨基糖(tang)相(xiang)連成核糖(tang)單位的(de)多價陽離(li)子復合物。氨基甙(dai)類通過與(yu)細(xi)菌核糖(tang)體不(bu)可逆(ni)結(jie)合而干(gan)擾細(xi)菌蛋(dan)白(bai)質的(de)合成，進而導(dao)致細(xi)胞膜塌陷。氨基甙(dai)類藥物的(de)主(zhu)要(yao)副(fu)作用是對聽(ting)覺(jue)器官和腎的(de)毒性、過敏(min)反(fan)應以及對神經(jing)(jing)肌肉的(de)影響。其中，慶大霉(mei)(mei)素(su)(su)能引起肝功(gong)紊(wen)亂(luan)(luan)、外周和中樞神經(jing)(jing)炎(yan)（包括(kuo)腦炎(yan)、呆滯、抽搐）；鏈(lian)(lian)霉(mei)(mei)素(su)(su)能導(dao)致神經(jing)(jing)紊(wen)亂(luan)(luan)，包括(kuo)視覺(jue)神經(jing)(jing)炎(yan)和外周神經(jing)(jing)炎(yan)，以及嚴重的(de)皮炎(yan)、過敏(min)等(deng)(deng)超(chao)敏(min)感反(fan)應。
二、獸藥(yao)殘留的快速檢測方(fang)法(fa)
目前上(shang)對抗生素和激素類藥物(wu)殘留的(de)(de)檢測主要有儀器(qi)分(fen)析法(fa)（包括(kuo)HPLC和GC-MS）和生物(wu)學快速(su)檢測法(fa)（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其(qi)中，儀器(qi)分(fen)析法(fa)既要求(qiu)儀器(qi)設備具有相當高的(de)(de)精度，也要求(qiu)技(ji)術人員具有一定的(de)(de)操作(zuo)和分(fen)析技(ji)能。作(zuo)為(wei)儀器(qi)分(fen)析法(fa)，其(qi)昂(ang)貴的(de)(de)價格(ge)和軟件更新的(de)(de)緩慢(man)以(yi)及(ji)操作(zuo)上(shang)的(de)(de)煩(fan)瑣限制了此法(fa)的(de)(de)推廣；但由于檢測的(de)(de)靈敏度可以(yi)達到(dao)ng水(shui)平，在一些國家(jia)大(da)型實驗室里(li)仍作(zuo)為(wei)檢驗的(de)(de)參考依據使用。而生物學快速檢測法由(you)于其(qi)(qi)操(cao)作上的簡(jian)便(bian)、快(kuai)速以及達到(dao)ng水平(ping)的靈敏度(du)等優點(dian)，以成為(wei)動物(wu)產品中(zhong)獸藥殘留檢(jian)測(ce)的一種重要手段。尤其(qi)(qi)是ELISA（酶聯免疫吸(xi)附試驗）和CharmⅡ，其(qi)(qi)操(cao)作上的簡(jian)便(bian)、快(kuai)速和強烈的信(xin)噪比、達到(dao)ng水平(ping)的靈敏度(du)等優點(dian)，其(qi)(qi)缺陷在(zai)于該法會(hui)出現(xian)假(jia)陽性結(jie)果，但做為(wei)一種快(kuai)速篩選方法備(bei)受(shou)技術人員的青睞(lai)，在(zai)檢(jian)測(ce)部門有著(zhu)廣(guang)泛的應用(yong)前(qian)景。
1、ELISA檢測
1.1 所需儀器(qi)設備(bei)
酶標儀：常(chang)用的(de)有美國的(de)bio-lab（百樂），Bio-Tex,芬蘭(lan)Labsystem等，價格在5萬人(ren)民幣左右(you)；
氮氣(qi)吹干儀：美(mei)國 Organomatic Associates，2萬左右；
洗(xi)板機（不一定要配(pei)置(zhi)）：與酶(mei)標(biao)儀相應，價格在3-4萬人民幣左右(you)；
離(li)心機：6000g/min，國(guo)產價(jia)格在5000左右；
均(jun)質(zhi)器(qi)：德國IKA，人民幣6000左右；（拍(pai)式均(jun)質(zhi)器(qi)：1-2萬）
移液器：單道：1550/件，多(duo)道：5000/件；
恒溫培養箱：
固相萃取(qu)儀：
1.2常用ELISA試劑(ji)盒
英國朗道（RANDOX），德(de)(de)國拜發（r-Biopharm），德(de)(de)國Riedel-deHaen，荷蘭E-D，美國(guo)NEOGEN，意(yi)大利Tecna等。
1.3檢(jian)測原理（競爭法）
1.3.1 抗原抗體的基本結構
1.3.2檢測的基礎是基于抗原抗體的膠體特性與極性基的吸附作用。抗體的蛋白質（免疫球蛋白），大多數抗原也是蛋白質，在水溶液中都具膠體特性，并帶電荷，形成相對穩定的親水膠體。同時抗原、抗體含有羧基、氨基及肽鏈等極性基團，當兩者由于理化特性相吻合互相吸引而結合后，成為憎水膠體系統。抗原和抗體的相互吸引和結合是依靠下列各種分子間引力所促成：
庫侖(lun)吸引(yin)(yin)力/靜電引(yin)(yin)力，抗(kang)原和(he)抗(kang)體分子(zi)相(xiang)反電荷的(de)氨基和(he)羧(suo)基之間(jian)相(xiang)互吸引(yin)(yin)而促(cu)成；
范德華(hua)引(yin)力(li)(li)，由于(yu)抗原和抗體分(fen)(fen)子的外層電(dian)子之間相互作(zuo)用的擾(rao)動(dong)產生一種(zhong)引(yin)力(li)(li)，引(yin)起(qi)分(fen)(fen)子吸(xi)引(yin)而(er)發生結合，這種(zhong)作(zuo)用取決于(yu)分(fen)(fen)子的空間構(gou)型(xing)；
氫鍵結合作用，具-OH、-NH2、-COOH等親水基團的抗體和相應的抗原接近時，可形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，使得抗原抗體結合；
疏水作用，抗原抗體分(fen)子側鏈上的(de)某些氨(an)基酸(suan)(suan)（如亮氨(an)酸(suan)(suan)、頡氨(an)酸(suan)(suan)及苯(ben)丙氨(an)酸(suan)(suan)等）為疏水基團，當抗原抗體分(fen)子表面上的(de)這些疏水基團密切接(jie)觸時可排除水分(fen)子，在(zai)兩者(zhe)之間產生相互吸引力而發生結(jie)合。
1.3.3抗原抗體(ti)的結(jie)合具有：
特異性：取決于抗原決定簇的數量、性質和立體構型；抗體Fab段的高變區和相應抗原決定簇的結合能力. 所以抗原抗體的種類質量直接影響結果
可逆行: 結合僅是分子表面的結合,而非共價鍵的結合,具有相對穩定性但為可逆反應.一定條件下（低PH、冬融、高濃度鹽等）所以緩沖液很重要
zui適比例性：兩者量需具一定的量比關系才發生zui強的結合反應。所以抗原抗體的數量也是重要因素
反應(ying)具(ju)階段性(xing)：受(shou)環境中電解質、溫度、PH、等(deng)因素的影響(xiang)。所以在ELISA實驗時各種步驟一定(ding)要(yao)準確到位。
1.3.4以(yi)氯霉素(su)為例：
酶(mei)(mei)標(biao)板包(bao)被(bei)針對兔IgG（氯(lv)霉(mei)素(su)(su)抗體）的(de)羊(yang)(yang)抗體。加入氯(lv)霉(mei)素(su)(su)抗體，氯(lv)霉(mei)素(su)(su)酶(mei)(mei)標(biao)記(ji)物，氯(lv)霉(mei)素(su)(su)標(biao)準液或(huo)樣品溶液。游(you)離氯(lv)霉(mei)素(su)(su)與(yu)氯(lv)霉(mei)素(su)(su)酶(mei)(mei)標(biao)記(ji)物競爭氯(lv)霉(mei)素(su)(su)抗體結(jie)(jie)合(he)(he)位點，同時氯(lv)霉(mei)素(su)(su)抗體也(ye)與(yu)固定的(de)羊(yang)(yang)抗體結(jie)(jie)合(he)(he)。沒有結(jie)(jie)合(he)(he)的(de)氯(lv)霉(mei)素(su)(su)酶(mei)(mei)標(biao)記(ji)物在洗滌(di)步(bu)驟中(zhong)被(bei)除去。將(jiang)酶(mei)(mei)基質和發色劑加到板孔(kong)中(zhong)并孵育(yu)。結(jie)(jie)合(he)(he)的(de)氯(lv)霉(mei)素(su)(su)酶(mei)(mei)標(biao)記(ji)物將(jiang)無色的(de)發色劑轉化(hua)為藍色產物。加終止液后使顏色由藍(lan)變黃。用450nm判讀，吸光度值與樣品中氯霉素(su)含量成反比。 大多(duo)數試(shi)劑盒包被(bei)的是二抗(kang)。
RONDOX的試(shi)劑盒是直(zhi)接將氯(lv)(lv)霉(mei)素(su)(su)特異性抗體(ti)預包被酶標(biao)(biao)板上(shang)，當(dang)在酶標(biao)(biao)孔中(zhong)加(jia)入樣品和酶標(biao)(biao)記氯(lv)(lv)霉(mei)素(su)(su)后(hou)，樣品中(zhong)的氯(lv)(lv)霉(mei)素(su)(su)和酶標(biao)(biao)記氯(lv)(lv)霉(mei)素(su)(su)競(jing)爭(zheng)抗體(ti)結(jie)合(he)位點，洗滌后(hou)底物顯色(se)(se)，加酸終止之后，顏(yan)色(se)(se)由藍變黃。用450nm判讀，顏(yan)色(se)(se)深度與(yu)樣(yang)品中氯(lv)霉素含量成反比(bi)。
不同的ELISA原理直接影響其(qi)檢測下限(xian)、特(te)異性(xing)及結果的計算。
1.4 樣品的前處理
不(bu)同樣品有其特定(ding)的前(qian)處理(li)方法，主要有以下幾種(zhong)：
1.4.1有機物抽提(ti)法：（氯霉素(su)）
利用(yong)藥(yao)物(wu)在(zai)有機物(wu)中的溶解(jie)性(xing)，達到分(fen)離純化的目的
樣品均質 稱量 乙晴和或乙酸乙酯抽(chou)提 離心 吹干
異辛烷/氯(lv)仿或(huo)正(zheng)己烷抽提(ti) 離心 取水(shui)相(xiang)分(fen)析
1.4.2離子(zi)交換(huan)法（如：C18過柱法）（鏈霉素）
離子交(jiao)換(huan)(huan)是利用一些(xie)帶離子基團的(de)物(wu)質(zhi)，吸附交(jiao)換(huan)(huan)帶相反電荷的(de)蛋白質(zhi)，將(jiang)蛋白質(zhi)按所(suo)帶電荷不(bu)同(tong)或量的(de)差異分成不(bu)同(tong)的(de)組分。
樣品稱量 溶解 上柱
C18柱平衡 洗柱 吸柱干燥 洗提(ti) 吹干(gan)
緩沖液重懸 分析
1.4.3（免疫）親和層析（雌激(ji)素）
利用生(sheng)(sheng)物大分子的(de)(de)生(sheng)(sheng)物學特性而設計的(de)(de)層析分離技(ji)術，如利用抗(kang)原和(he)(he)(he)抗(kang)體、酶和(he)(he)(he)酶的(de)(de)抑制物或配體、激素(su)和(he)(he)(he)受體等之間的(de)(de)親和(he)(he)(he)力，在一(yi)定條件下，兩者可(ke)緊密結合形成復(fu)合物，若(ruo)將其中一(yi)者固定在載體上(shang)，則(ze)可(ke)從溶液中提取和(he)(he)(he)分離相應的(de)(de)另一(yi)方，并達到(dao)很高(gao)的(de)(de)純度。現(xian)有商品化生(sheng)(sheng)產，（方便(bian)，減少裝(zhuang)柱等繁瑣步驟）其操作(zuo)步驟與上(shang)者相似，可(ke)以按照試(shi)劑(ji)盒(he)提供的(de)(de)步驟進行。
1.5酶(mei)標免疫(yi)分析程序（室(shi)溫20-240C條件下操作）
每一個盒中的試(shi)劑(ji)足(zu)夠(gou)進行96個測量（包(bao)括標準測定孔(kong)），以E-D CAP檢測試(shi)劑(ji)盒為例：
1）取(qu)出試劑盒恢復至室(shi)溫，充分混均(jun)；
2）釋緩沖(chong)液(ye)（以ddw）稀釋(shi)備(bei)用(yong)（也(ye)可用(yong)磷酸鹽緩(huan)沖液，但要）；
3）洗(xi)緩沖(chong)液（以ddw）稀釋備(bei)用(yong)，也可用(yong)PBST（磷酸鹽土溫—20緩沖液）；
4）酶標記物的配制：按(an)試(shi)劑盒說明配置(zhi)、混均，2-8度陰暗(an)處保存；
5）抗體的配制：按試劑盒說(shuo)明配置(zhi)、混均，2-8度陰暗處保存；
6）取足夠的(de)微空條，記錄加樣順序；
7）a．吸取100微升稀釋(shi)緩沖液A1、A2（試劑空白(bai)），
b．吸(xi)取50微升稀釋緩(huan)沖液(ye)到B1、B2（零標(biao)準），
c．吸取50微升標準(zhun)液(ye)到C—H孔，
d．加50微升樣(yang)品到其余孔；
8）加酶標記物和抗體到除A1、A2的所有(you)孔；
10）蓋膜，震(zhen)蕩1分鐘；
11）在一定條件下孵育(yu)；
12）洗板，一定(ding)要*充分，并且(qie)次(ci)數固(gu)定(ding)，推薦用洗板機（百樂）；
13）加底物，室溫培養（25度）孵(fu)育(yu)；
14）加終(zhong)止液；
15）450nm波長下讀(du)數。
1.6標準曲(qu)線的繪制
a．每個(ge)標準液或樣品的OD值均要減去空白A1、A2的(de)OD值(zhi)，
b．標準液和樣品的OD值除以零標準（B1、B2）的OD值
c． 繪制半對數曲(qu)線(xian)（以B/B0為Y軸，標準樣(yang)品濃度的(de)對(dui)數為X軸），可用一些(xie)專業(ye)軟件，也可用半對數紙或(huo)在EXCEL上繪(hui)制(zhi)。
2、CharmⅡ檢測(ce)
CHARM II 6600/7600分析儀(yi)是(shi)一臺多功能、單樣品的液體閃爍（LSC）和(he)生物發光計數器。該法具有(you)快(kuai)速、簡(jian)便(bian)的特點，但(dan)其假陽性率教高，適宜快(kuai)速篩選
2.1儀器組成：
Charm II 6600 / 7600分析儀
Charm孵育器
CentraCL2離心機
均質器、移液器
2.2 檢測原理
微生物受體(ti)免疫(yi)分(fen)析(xi)法(fa)，屬于免疫(yi)分(fen)析(xi)法(fa)的一種(zhong)，其建立的基礎是(shi)藥物功(gong)能團(tuan)與微生物受體(ti)位(wei)點(dian)的結合(he)(he)反(fan)應。在某些(xie)方面類(lei)似于放射免疫(yi)分(fen)析(xi)（RIA），所不(bu)同的是(shi)RIA使(shi)用抗體(ti)作為結合(he)(he)劑(ji)，而(er)受體(ti)分(fen)析(xi)則(ze)是(shi)使(shi)用細(xi)菌細(xi)胞的固定位(wei)點(dian)當做特殊的結合(he)(he)劑(ji)。
一(yi)個單一(yi)的細菌(jun)細胞(bao)含有可結(jie)合(he)藥物(wu)的特殊結(jie)合(he)位點，藥物(wu)和受體位點的結(jie)合(he)反應(ying)離解(jie)常數低，因而具特異性和靈(ling)敏性。對(dui)于該法(fa)具體原(yuan)理Charm公司未有(you)詳(xiang)細深入的(de)報道(dao)（商業方(fang)面考慮(lv)），主要是利用兩種不(bu)同(tong)的(de)細菌提(ti)供7大類(lei)抗生素結(jie)合的(de)必須位(wei)點(dian)，藥物(wu)(wu)的(de)功能(neng)團與(yu)位(wei)點(dian)有(you)關，不(bu)象免疫分析只涉及(ji)到側鏈，一種微(wei)生物(wu)(wu)受體可結(jie)合一類(lei)藥物(wu)(wu)的(de)所有(you)藥物(wu)(wu)。
象ELISA類(lei)似，這種(zhong)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)也是一種(zhong)競爭(zheng)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)。在(zai)試(shi)管中加入(ru)一定量的細菌(jun)（受體(ti)(ti)）、放射性標記藥物和(he)樣品(pin)，樣品(pin)中的藥物和(he)放射性標記藥物競爭(zheng)結(jie)(jie)合(he)(he)(he)受體(ti)(ti)，未于(yu)受體(ti)(ti)位(wei)點結(jie)(jie)合(he)(he)(he)的標記性藥物在(zai)讀數前(qian)被(bei)去掉，加入(ru)閃爍液(ye)，在(zai)分(fen)析儀上(shang)讀數。
2.3檢測的一(yi)般程(cheng)序(xu)
2.3.1準(zhun)備工(gong)作：首先(xian)按說(shuo)明書配制好(hao)所需的提取緩沖液、M2緩沖(chong)液、陰性對照和(he)陽性對照。
儀(yi)器零(ling)點測定：用空試管測(ce)定儀器的零(ling)點(dian)是(shi)否(fou)正常。
試(shi)劑和(he)儀器有效(xiao)性(xing)確認：檢測陰性(xing)對照液和陽(yang)性(xing)對照液各(ge)3次(ci)，求出cpm值(zhi)的(de)平均值(zhi)，與出廠的(de)計數單(dan)對比，能在(zai)其±10%左右波(bo)動(dong)。如果與(yu)計數(shu)單(dan)相比(bi)偏移(yi)較大(da)，試劑可能部分失效，但(dan)只要陽性平均值/陰性(xing)平均值小于0.7，試(shi)劑仍然(ran)可用，但靈敏度(du)會有所(suo)降低(di)。
控(kong)制點(dian)(dian)的確(que)定：控(kong)制點(dian)(dian)是陰(yin)性結(jie)(jie)果(guo)與陽性結(jie)(jie)果(guo)的臨(lin)界值。利用(yong)控(kong)制點(dian)(dian)來判斷結(jie)(jie)果(guo)。有兩(liang)種確(que)定控(kong)制點(dian)(dian)的方法：根據樣品的(de)種類(lei)或檢測水(shui)平選擇適(shi)當的(de)控制(zhi)點(dian)確定方(fang)法。控制(zhi)點(dian)確定方(fang)法有二。有些說明書上(shang)兩種方(fang)法都列出，用戶可(ke)根據需要(yao)選擇，選第(di)二種。
方(fang)法一：直接以陰性對照(zhao)來確定控(kong)制點，一般樣(yang)品干擾(rao)小(xiao)或接近儀器的下*，采(cai)用這種方法(fa)，只需再做3次，與前3次試劑性能確認(ren)的結果一起求(qiu)平均值，然(ran)后減法X%，即為控制點。X為(wei)變(bian)數，由廠家用(yong)定量方法(fa)校準。
方法二：以空白加標樣(yang)(yang)(yang)品來(lai)確(que)定控(kong)制(zhi)點。這種方法的(de)關鍵是找(zhao)到陰性樣(yang)(yang)(yang)品，如(ru)果(guo)沒(mei)有其它的(de)定量方法找(zhao)陰性樣(yang)(yang)(yang)品，可根據陰性對(dui)(dui)照(zhao)平(ping)均(jun)值(zhi)來(lai)找(zhao)陰性樣(yang)(yang)(yang)品（陰性對(dui)(dui)照(zhao)平(ping)均(jun)值(zhi)±X%）。用此(ci)陰性樣(yang)品(pin)，按檢測水(shui)平和稀(xi)釋倍數，加(jia)抗生(sheng)素標準品(pin)，用此(ci)空白(bai)加(jia)標樣(yang)品(pin)，測定6次(ci)CPM值，求平均值，控制點＝平均值＊（1＋20%）。
2.3.2測定實際(ji)樣品(pin)
前(qian)處理(li)：不(bu)同(tong)的樣品具不(bu)同(tong)的前(qian)處理(li)方法，一般尿樣、血(xue)(xue)清、血(xue)(xue)漿(jiang)等(deng)只(zhi)需用緩沖液稀(xi)釋即(ji)可(ke)，而組織樣品則需均質、提取、孵育等(deng)過(guo)程，對于蜂蜜等(deng)一些樣品則要過(guo)柱。總(zong)的來(lai)說，前(qian)處理(li)要比ELISA更簡便、快速。
按照操(cao)作(zuo)說明檢測結合試(shi)劑片加(jia)入(ru)試(shi)管；加(jia)入(ru)300微(wei)升水(shui)混(hun)均；加(jia)入(ru)處理過的(de)樣品(pin)；加(jia)入(ru)標記(ji)性藥物，混(hun)合；孵育；離心，棄去(qu)上清液；加(jia)水(shui)混(hun)均；加(jia)閃爍液，混(hun)均；讀數。
三、實驗室分析質量(liang)控制
涉及儀器的校正、過程控(kong)制、標準物控(kong)制、環境、實驗(yan)室管理（監控(kong)所進行(xing)的測試及記錄結(jie)果(guo)，以便(bian)發(fa)現發(fa)展趨(qu)勢，統計技術(shu)進行(xing)結(jie)果(guo)評審）
1、快速篩選(xuan)方法及定性方法
選擇性(xing)：檢(jian)出目的物質的能力；
靈敏性：樣品中檢出這種藥物真正陽性結果的比率；
準確(que)性(xing)(xing)：所得值(zhi)和真實(shi)值(zhi)的(de)一致性(xing)(xing)，用不確(que)定度來衡量——重復多次測(ce)定值(zhi)和真實(shi)值(zhi)之差；
檢測限(xian)：分析方法能從樣品背(bei)景信號中檢測出待(dai)檢物質(zhi)的zui低濃度(du)；
重復性：
2、定量方(fang)法(fa)的(de)附加要求
回收率：
定量限：分析(xi)方法(fa)能對樣品中待檢(jian)物質進行定量檢(jian)測的zui低濃(nong)(nong)度，反映該方法(fa)在低濃(nong)(nong)度端分析(xi)結(jie)果(guo)的可(ke)靠性；
精密度：對同一樣品重復測定，每(mei)次測定值(zhi)和均值(zhi)的接(jie)近(jin)程(cheng)度，主要(yao)反映隨機誤差；
重(zhong)(zhong)復(fu)性：批內重(zhong)(zhong)復(fu)、批間重(zhong)(zhong)復(fu)線形范圍：曲線的擬和
